Příznaky, jenž roztroušená skleróza vykazuje jsou společné pro vícero zdravotních potíží, což diagnostiku značně komplikuje. Věda za poslední roky však udělala značné pokroky ve vyšetřovacích metodách, což umožňuje s velkou pravděpodobností stanovit konečnou diagnózu roztroušené sklerózy již po prvních příznacích. Nejdůležitější úlohu hraje magnetická rezonance a lumbální funkce, jež v případě potřeby ještě doplňuje počítačová tomografie, evokované potenciály a Elektromyografie.
Při lumbální punkci se pacient položí na záda či se předkloní v sedě na židli a do oblasti pod čtvrtý obratel mu je vpíchnuta jehla, s níž se odebere vzorek mozkomíšního moku. Tato čirá tekutina se nachází v oblasti mozku a míchy. Její funkcí je tyto důležité orgány chránit před nárazy a prudkými pohyby. Mozkomíšní mok je tvořen glukózou, proteiny, soli a lymfocyty. Tento test může prokázat chronický zánět centrální nervové soustavy, obzvláště podstatná je hladina oligoklonálních proužků, jenž se mimo meze objevuje u 80% pacientů trpících sklerózou.
Magnetická rezonance hraje významnou roli při detekci onemocnění mozku a míchy, neboť je při ní zřetelně rozlišené zabarvení jednotlivých mozkových hmot. Oblasti, kde již došlo k demyelinizaci, se projevují lézemi a plaky, které jsou viditelné jako bíle skvrny. Při nutnosti zvýraznit aktivní léze se používá kontrastní látka. Použitím magnetické rezonance se dají tyto léze objevit i u pacientů, kteří ještě nevykazují žádné viditelné symptomy. Avšak jako primární metoda vyšetření nelze používat, protože přibližně u pětiny pacientů chybně vyhodnocuje normální nález, i když prokazatelně trpí roztroušenou sklerózou.
Počítačová tomografie nabízí možnost prozkoumat řezy orgánů z mnoha úhlů. Přičemž jsou na rozdíl od rentgenu viditelné i měkké tkáně, což může odhalit případný nádor. Na rozdíl od magnetické rezonance jsou však šedá a bíla kůra mozková špatně rozpoznatelné. Evokované potenciály obdobně jako EEG měří elektrickou aktivitu mozku. Cílem je ověřit reakce pacienta na podměty a zda se dostávají do mozku. Testovány jsou vizuální, sluchové a hmatové vjemy, u nichž se hodnotí prodleva mezi podmětem a reakcí. Součástí je i test vnímání bolesti, kdy je za pomoci elektrody na zápěstí či kotníku aplikován slabý výboj. Výsledky nemusí být vždy naprosto průkazné, proto je využívána jen jako přidružená metoda diagnostiky. Elektromyografie se používá při slabosti svalů. Do svalu je vpravena elektroda, jenž měří elektrické napětí v klidové i zátěžová fázi. Na základě výsledků se dá vyvodit závěr, zda jsou potíže způsobeny onemocněním svalů či nervové soustavy.